Spektroskopia korelacyjna fluorescencji (FCS) powstała w latach 70., a jej znaczenie eksplodowało wraz z pojawieniem się mikroskopii konfokalnej w latach 90. Pozwoliła badaczom po raz pierwszy analizować zjawiska w skali pojedynczych cząsteczek – ruch cząsteczek w cytoplazmie, reakcje chemiczne, formowanie agregatów białkowych czy przyłączanie się cząsteczek do błon komórkowych. To dzięki niej możliwe stało się śledzenie dynamiki procesów życiowych w objętościach rzędu femtolitra, czyli jednej biliardowej litra – mniej więcej tyle, co jedno ziarenko piasku w olimpijskim basenie.
Czytaj też: Fizyka kwantowa na nowo zdefiniowana. Naukowcy znaleźli sposób na ominięcie legendarnej bariery
Jednak mimo ogromnych sukcesów FCS miała od początku ukryty problem: dane, na których opierała się analiza, nie były statystycznie niezależne. Technika ta oblicza tzw. autokorelację, czyli zależność między intensywnością sygnału fluorescencji w różnych chwilach. Na tej podstawie określa się, jak szybko poruszają się cząsteczki i jak reagują w mikroskopowej przestrzeni. Problem w tym, że wszystkie te obliczenia bazują na tym samym zestawie danych – jednym ciągu sygnału. To tak, jakby próbować wyciągać wnioski o pogodzie z jednego dnia pomiarów, obliczając tylko podobieństwa między kolejnymi godzinami. Wynik może wyglądać precyzyjnie, ale w rzeczywistości jest obarczony dużym błędem.
Aby poprawnie ocenić wiarygodność wyników, należałoby wielokrotnie powtarzać pomiar lub znacząco wydłużyć jego czas. W praktyce to niemożliwe – zbyt długie naświetlanie próbki niszczy komórki, a fluorescencyjne barwniki ulegają fotodegradacji. Dlatego przez dekady naukowcy stawali przed trudnym wyborem: używać FCS w sposób nie do końca poprawny statystycznie, albo w ogóle zrezygnować z badania zjawisk, które zachodzą zbyt szybko i w zbyt małych objętościach.
Jak działa FCS – i dlaczego to takie trudne
Dla lepszego zrozumienia istoty problemu można porównać FCS do eksperymentu z dwoma kasjerami. Wyobraźmy sobie, że chcemy sprawdzić, który z nich obsługuje klientów szybciej. Zamiast mierzyć ich tempo w godzinach szczytu, gdy kolejka się nie kończy, pozwalamy im pracować w spokojniejszych momentach i notujemy, kiedy każdy klient pojawia się przy kasie i kiedy odchodzi. Na tej podstawie można obliczyć średni czas obsługi. W FCS rolę klientów odgrywają pojedyncze molekuły wchodzące i wychodzące z mikroskopowej objętości.
Czytaj też: Elektron w pół drogi. Naukowcy odkryli brakujące ogniwo reakcji chemicznych
Ale na poziomie molekularnym rzeczy stają się znacznie trudniejsze. Cząsteczki nie zawsze emitują fotony, część sygnałów ginie w tle, inne nakładają się przypadkowo. Dane są więc ekstremalnie zaszumione. FCS rozwiązuje to przez rejestrowanie sygnałów z ogromną częstotliwością – miliony pomiarów na sekundę – i analizę statystyczną w poszukiwaniu powtarzających się wzorców. Właśnie tu pojawia się autokorelacja, która mierzy prawdopodobieństwo, że po chwilowym wzroście fluorescencji pojawi się kolejny wzrost po pewnym czasie. Tak naukowcy odczytują prędkości ruchu molekuł czy ich interakcje.
Jednak ponieważ wszystkie te dane pochodzą z jednej serii pomiarów, każda “nowa” korelacja nie jest nowym eksperymentem, lecz innym sposobem spojrzenia na te same liczby. W efekcie błędy się sumują, a margines niepewności rośnie – szczególnie, gdy eksperyment trwa krótko.
FITSA: analiza sygnału bez pośredników
Zespół z Laboratorium Biologii Systemowej na Politechnice w Tallinnie (TalTech) postanowił rozwiązać ten problem u źródła. Opracowali metodę FITSA (Fluorescence Intensity Trace Statistical Analysis), która zamiast liczyć autokorelacje, analizuje bezpośrednio surowy sygnał fluorescencji. Do tego celu wykorzystali narzędzia obliczeniowe stosowane w sztucznej inteligencji, ale w odróżnieniu od typowych “czarnych skrzynek” AI, FITSA bazuje na przejrzystych modelach fizycznych opisujących procesy zachodzące w mikroskopowej objętości.
Kluczowa różnica polega na tym, że FITSA nie potrzebuje tak wielu danych – ani tak dokładnej wiedzy o parametrach cząsteczki (np. jej jasności fluorescencji). W tradycyjnych analizach drobna pomyłka w tych wartościach mogła prowadzić do całkowicie błędnych wyników. FITSA eliminuje tę zależność, stając się znacznie bardziej odporna na błędy użytkownika.
Według badań opublikowanych w Science Advances, nowa metoda wymaga od 300 do 21 tys. razy mniej danych niż klasyczna analiza FCS wykonana zgodnie z zasadami statystyki. Nawet w porównaniu z “niepoprawnie” stosowaną wersją FCS, FITSA jest kilkukrotnie bardziej wydajna. To ogromna różnica, która pozwala skrócić czas eksperymentu z godzin do minut – bez utraty precyzji.
Nowe podejście ma potencjał, by całkowicie zmienić sposób prowadzenia badań molekularnych. FITSA otwiera możliwość badania procesów, które wcześniej były poza zasięgiem FCS – szczególnie w żywych komórkach, gdzie długie naświetlanie jest niemożliwe. Naukowcy mogą teraz analizować ruch białek w sercu czy sygnały wewnątrz neuronów w czasie rzeczywistym.
Zespół z TalTech testował metodę m.in. na komórkach mięśnia sercowego szczura, pokazując, że możliwe jest wiarygodne określenie prędkości dyfuzji cząsteczek i ich reakcji w objętościach znacznie mniejszych niż dotąd. W dalszej perspektywie FITSA może znaleźć zastosowanie w farmakologii – przy analizie, jak cząsteczki leków wnikają w komórki lub jak wiążą się z białkami docelowymi – oraz w inżynierii materiałowej, gdzie pozwoli badać procesy samoorganizacji nanostruktur i polimerów.
Choć FITSA rozwiązuje kluczowy problem metodologiczny, jej autorzy podkreślają, że to dopiero początek. Przed zespołami badawczymi stoi zadanie integracji tego podejścia z istniejącymi systemami mikroskopowymi i opracowania oprogramowania, które umożliwi automatyczną analizę w czasie rzeczywistym. Jeśli to się uda, FITSA może stać się nowym standardem w analizie fluorescencji molekularnej – tak, jak FCS była nim przez ostatnie pięć dekad.